具有致病性線(xiàn)粒體DNA (mtDNA)點(diǎn)突變的患者通常會(huì )出現致殘性神經(jīng)系統綜合征，導致嚴重殘疾和過(guò)早死亡^[1]。至少有1/5000的人口受到mtDNA疾病的影響^[2]。線(xiàn)粒體遺傳疾病的單核苷酸多態(tài)性(SNP)通常存在異質(zhì)性^[3]，即：野生型和突變型共存。突變異質(zhì)率不同的個(gè)體表現出不一樣的臨床癥狀^[1]。同質(zhì)的mtDNA突變可以很容易地在血液中檢測到。然而，對于異質(zhì)突變，突變mtDNA的百分比水平因組織而異，并且在同一個(gè)體中也可能隨時(shí)間而變化(例如，導致Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)的m.11778A>G)。因此SNP異質(zhì)率的精確檢測對線(xiàn)粒體遺傳疾病的診斷至關(guān)重要。最近，基于CRISPR的分子診斷技術(shù)因其特異性強、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注^{[4, 5]}。例如，巢式RPA和CRISPR/Cas12a輔助病毒鑒定的多重分析平臺(MAPnavi)被用于快速(< 40分鐘)診斷多種呼吸道病毒^[6]。然而，這些單信號輸出方法難以準確診斷mtDNA疾病的異質(zhì)性水平，因為結果受到樣本中模板總量的影響。與基因組SNP基因分型不同，mtDNA疾病的異質(zhì)性水平診斷需要更準確的SNP豐度定量，這仍然是一個(gè)挑戰。

化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院劉翼振副教授團隊在生物傳感器頂級期刊《Biosensors and Bioelectronics》上發(fā)表了題為“RatioCRISPR: A Ratiometric Biochip Based on CRISPR/Cas12a for Automated and Multiplexed Detection of Heteroplasmic SNPs in Mitochondrial DNA”的研究，2022級化學(xué)專(zhuān)業(yè)碩士研究生吳小龍為第一作者，陳勇副研究員和劉翼振副教授為共同通訊作者，深圳大學(xué)為唯一通訊單位。

Link:https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115676

該研究提出了一種自動(dòng)化的CRISPR/Cas12a比例型生物芯片傳感器(RatioCRISPR)，用于準確量化線(xiàn)粒體疾病SNP的異質(zhì)性水平：首先，從mtDNA疾病患者的血液樣本中提取DNA。然后與RPA擴增試劑混合，從樣品孔中加入到芯片。之后，芯片將按照預設程序自動(dòng)運行(圖1a)。而后，采用比率信號輸出的方法，提高了穩定性，最大限度地減少了樣品濃度對異質(zhì)性水平檢測的影響，使診斷結果只與模板中野生型和突變型的相對含量有關(guān)。最終RatioCRISPR實(shí)現了在25分鐘內同時(shí)準確地檢測8個(gè)樣品，檢出限(LOD)為15.7 aM。并成功檢測了3種mtDNA點(diǎn)突變(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)的13個(gè)模擬樣本，這些突變導致Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)^[8]，并設定了異質(zhì)性閾值(60%)來(lái)評估疾病風(fēng)險。這種自動(dòng)化、精確的生物傳感器在診斷多個(gè)SNP，特別是具有異質(zhì)性的SNP具有廣泛的應用，為遺傳咨詢(xún)、流行病學(xué)研究和多種異質(zhì)SNP疾病提供了一個(gè)快速、經(jīng)濟、實(shí)時(shí)的臨床診斷平臺。

圖1 RatioCRISPR用于mtDNA疾病診斷的示意圖

作者提出了一種通用的、自動(dòng)化的RPA-CRISPR/Cas12a比率測定芯片(RatioCRISPR)，用于mtDNA疾病的診斷。作者首次嘗試在基于CRISPR/Cas的生物芯片中引入比值信號輸出方法，實(shí)現SNP相對豐度的精確定量。該平臺具有以下優(yōu)點(diǎn):1）建立比率型信號輸出系統來(lái)量化異質(zhì)性水平，使樣品濃度的影響減小。2）集成式封閉芯片設計，避免氣溶膠污染，實(shí)現多路自動(dòng)化檢測。這種先進(jìn)、便捷的生物傳感器具有通用性、自動(dòng)化程度高、準確度高等特點(diǎn)，在診斷多個(gè)SNP，特別是具有異質(zhì)性變異的SNP方面具有良好的實(shí)用性和市場(chǎng)應用前景。

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